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Fluoreszenz ist Lichtabstrahlung nach Lichtabsorption.
Bei Pflanzen ist die dunkelrote Chlorophyll-Fluoreszenz am besten untersucht. Daneben gibt es auch die in letzter Zeit stärker untersuchte Blau-Grün-Flureszenz, die von phenolischen Substanzen (z.B. Ferulasäure) der Epidermis gemessen wird.
Da intakte Pflanzen die Energie, die sie bei der Lichtabsorption von Chlorophyll aufnehmen auch in die Photosynthese umsetzen können, kann man aus der Höhe der Fluoreszenz auf die Intensität der Photosynthese schließen. Der in erster Näherung reziproke Zusammenhang zwischen Chlorophyllfluoreszenz und Photosynthese ist schon vor fast 70 Jahren von H. Kautsky (Kautsky H, Hirsch A (1931) Neue Versuche zur Kohlenstoffassimilation. Naturwissenschaften 19: 964) untersucht worden. Die Änderung der Chlorophyllfluoreszenz eines Blattes beim Übergang vom Dunkeln ins Licht (Induktionkinetik oder "Kautsky-Effekt") gibt Informationen über die Photosyntheseaktivität, die wesentlich einfacher zu erzielen sind als mit den üblichen Photosynthesemeßmethoden (CO2-Aufnahme oder O2-Abgabe).
Wird die Fluoreszenz spektral aufgelöst, so kann man aus dem gemessenen Fluoreszenz-Emissionsspektrum auf die Farbstoffzusammensetzung einer Probe schließen. Die Fluoreszenz des Chlorophylls liegt zwischen 650 und 800 nm mit Maxima bei 690 nm (dunkelrot) und 740 nm (nahes infrarot). Die Fluoreszenz von phenolischen Substanzen liegt zwischen 350 und 600 nm mit Maxima bei 440 nm (blau) und 540 nm (grün). Das messbare Fluoreszenzemissionsspektrum eines Blattes wird wesentlich beeinflusst durch die Absorption der Farbstoffe, die ein Teil des innerhalb des Blattes emittierten Fluoreszenzlichtes re-absorbieren. Aus der Re-absorption kann man aber auch auf die Farbstoffkonzentration schließen. Das Emissionsspektrum der Chlorophyllfluoreszenz eines intakten Blattes ändert sich beim Übergang vom Dunkeln ins Licht ("Kautsky-Effekt", siehe oben). Mit einem Spektrometer, das Spektren innerhalb weniger Millisekunden aufzeichnet, konnte 1981 erstmals gezeigt werden, dass dabei die Position der Fluoreszenzmaxima gleich bleibt jedoch die Relation des Maximum von 690 nm zu dem bei 740 nm absinkt (Buschmann C., Schrey H. (1981) Fluorescence induction kinetics of green and etiolated leaves by recording the complete in vivo emission spectra. Photosynthesis Research 1: 233-241).
Spektren der Chlorophyllfluoreszenz eines intakten grünen Blattes
während der Belichtung im Anschluss an eine Vorverdunkelung (Kautsky-Induktionskinetik):
Die Zeitachse geht von hinten (0 min) nach vorn.
In jüngster Zeit wird Fluoreszenzbildanalyse von Pflanzen durchgeführt. Dabei wird die Fluoreszenz von Pflanzen mit hochempfindlichen Videokameras aufgezeichnet. Aus der Verteilung der Fluoreszenzintensität kann man auf Farbstoffzusammensetzung und eventuell auf Photosyntheseaktivität schließen. Fluoreszenzbilder mit mehreren tausend Bildelementen sind viel aussagekräftiger als die sonst üblichen Fluoreszenzmessungen nur an einem Punkt der Probe. Außerdem können aus der Musterverteilung der Fluoreszenzsignale weitere Schlüsse gezogen werden (z.B. verschiedene Stress-Typen).
Fluoreszenzbild eines Platanenblattes:
Intensität der Chlorophyllfluoreszenz bei 740 nm in Falschfarbendarstellung
(Anstieg der Intensität: blau - grün - gelb - rot)
Bei der Messung der Reflexion wird die von einer Probe zurückgesendete Strahlung erfasst.
Die eingestrahlte Strahlung wird durch Absorption und Streueffekte, die für die Probe charakteristisch sind, verändert. Somit kann man aus der Reflexion auf die Probeneigenschaften schließen. Bei Pflanzen wird meist die Reflexion der Blätter gemessen, die die größte Fläche einer Pflanze ausmachen. Bei Blättern sind es speziell die Farbstoffe und die Epidermisauflage, die die Reflexion bestimmen und die aus Reflexionsspektren abgeleitet werden können. Speziell für die Verbesserung der Interpretation von Fernerkundungsdaten wurde ein Labor-Spektrometer entwickelt, das Reflexions-, Absorptions- und Fluoreszenzspektren im Sichtbaren und im Infraroten messen kann (VIRAF: Visible Infrared Reflectance Absorption Fluorescence). Vorteil des Gerätes ist es, das alle Spektren gemessen werden, ohne die Position der Probe zu ändern (bessere Vergleichbarkeit der Spektren als bei mehrmaliger Fixierung der Probe in unterschiedlichen Geräten). Außerdem können Blätter ohne Abtrennen von der Pflanze gemessen werden, so dass die Blattproben nicht austrocknen.
Photoakustik ist die Messung von Wärmeabgabe nach Lichtabsorption.
Der photoakustische Effekt wurde 1881 von Alexander Graham Bell entdeckt: Absorbiert eine Probe Licht, so nimmt das absorbierende Molekül die Lichtenergie auf und wird dabei von seinem Grundzustand in einen angeregten Zustand überführt. Danach geht das Molekül aus dem angeregten Zustand wieder in seinen Grundzustand über. Dabei wird Energie in Wärme (evtl. auch in Fluoreszenz und/oder Photochemie) umgeformt, die dann freigesetzt wird. Diese Wärme, die beim "strahlenlosen Übergang" des angeregten Moleküls entsteht wird durch die Photoakustik gemessen.
Bei einer photoakustischen Messung wird eine Probe in einen kleinen, dicht abgeschlossenen Probenraum, die photoakustische Zelle, eingeschlossen. Durch ein Glas, das die Zelle abdeckt, wird die Probe mit gepulstem Licht bestrahlt. Wenn das Licht absorbiert wird, so gibt die Probe Wärme an die umgebende Luft ab. Die erwärmte Luft dehnt sich aus. Da das eingestrahlte Licht gepulst ist, wird auch die Wärme in Pulsen abgegeben. Die durch Licht (Photo-) erzeugten Wärmepulse können als rhythmische Druckschwankungen mit einem Mikrophon (-Akustik) gemessen werden.
Photoakustische Messungen lassen sich an intakten Blättern durchführen. Der Vorteil photoakustischer Messungen an intakten Blättern besteht darin, dass:
(a) Absorptionseigenschaften gemessen werden können, ohne die sonst für Absorptionsmessungen typischen Probleme stark lichtstreuender Proben wie Blätter,
(b) die Messung der Absorptionseigenschaften für unterschiedliche Schichttiefen möglich ist, ohne vorherige Präparation ("Tiefenprofilanalyse") nur durch Änderung der Frequenz der Lichtpulse,
(c) die Messung der strahlenlosen Übergänge das Verständnis des Energiegleichgewichts photosynthetisch aktiver Proben komplettiert (absorbierte Lichtenergie wird umgesetzt in Photosynthese, Chlorophyllfluoreszenz und Wärme).
Die Ökophysiologie eignet sich als Anwendungsgebiet für die Umwelt- und speziell die Photosyntheseforschung.
Insbesondere die in vivo-Messungen der Fluoreszenz, Reflexion und Photoakustik können eingesetzt werden, um natürliche und anthropogene Stresseffekte zu bestimmen. Diese zerstörungsfreien Untersuchungsmethoden können an einzelnen Blättern im Labor oder Freiland durchgeführt werden und lassen Aussagen über die Pflanzen bzw. einen Pflanzenbestand zu, die mit anderen Messungen (z.B. auch Fernerkundung von Vegetation) verknüpft werden können.